Implementação Clínica do Algoritmo Molecular para NMP Ph-Negativo em Colaboração com o Hospital de Jerez

Desde o Departamento de Suporte e Aplicações da BIOMOL, partilhamos um caso recente de implementação de um fluxo diagnóstico completo para Neoplasias Mieloproliferativas Filadélfia Negativas (NMP Ph-), desenvolvido em colaboração com o Serviço de Hematologia do Hospital Universitário de Jerez de la Frontera.

O objetivo foi estruturar um algoritmo sequencial que permitisse a identificação precisa de mutações em BCR-ABL1, JAK2, CALR e MPL, integrando tecnologias como PCR em tempo real, HRM e sequenciação de nova geração (NGS), garantindo ao mesmo tempo a padronização nas plataformas 7500 Fast e SeqStudio.

Padronização: Equipamentos e Protocolos

1. BCR-ABL1 – Rastreio e Quantificação

• Para o rastreio e quantificação de BCR-ABL1, foi realizada uma transição do sistema LightCycler (LC) para o 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems).
• Esta migração foi efetuada sem necessidade de modificações adicionais, mantendo os padrões de deteção anteriormente estabelecidos.
• Foi desenvolvida uma curva padrão específica para a isoforma p190, permitindo uma quantificação robusta.
• Também foi validada uma curva para a isoforma p210, embora esta continue a ser quantificada por outra metodologia, conforme decisão do laboratório.

2. JAK2 V617F

• O diagnóstico desta mutação, presente em PV, TE e MFP, mantém-se com sondas e primers fornecidos pelo cliente, já otimizados para o sistema 7500. A intervenção da BIOMOL não foi necessária.

3. JAK2 Exão 12 – HRM

• O protocolo de High Resolution Melting (HRM) foi reinstalado no 7500, especialmente útil em casos com suspeita de Policitemia Vera e JAK2 negativo.
• Esta abordagem permite a discriminação de variantes menos frequentes, não detetadas por ASO-PCR.

4. CALR – Análise de Fragmentos

• O ensaio de CALR é realizado por análise de fragmentos no sistema SeqStudio.
• Foi prestado suporte técnico ativo, dado que o laboratório enfrentava dificuldades na visualização e análise. Após o ajuste dos parâmetros de eletroforese e do tamanho dos fragmentos, foram obtidos perfis interpretáveis e reprodutíveis.

Resultados Clínicos e Validação

O algoritmo foi aplicado a 414 pacientes com suspeita de NMP Ph-:

• BCR-ABL1 foi negativo em todos os casos.
• Foram identificados 40 pacientes positivos para JAK2 V617F.
• Nos negativos para JAK2, procedeu-se à análise do exão 12, seguida de sequenciação de CALR e MPL.
• Numa subcoorte negativa para BCR-ABL1 e JAK2, foi aplicada NGS, otimizando a deteção de mutações não clássicas.
• Todos os resultados positivos para JAK2, CALR ou MPL correlacionaram-se com o diagnóstico clínico final, o que reforça a solidez do algoritmo proposto.

Conclusões

A colaboração com o Hospital Universitário de Jerez demonstra a importância de contar com suporte técnico especializado na implementação de fluxos diagnósticos complexos em contexto clínico.

A contribuição da BIOMOL foi decisiva para a padronização de protocolos, adaptação das plataformas (7500 Fast e SeqStudio) e integração de metodologias avançadas como HRM e NGS. Esta abordagem estruturada permitiu garantir a rastreabilidade analítica e reforçar a fiabilidade do diagnóstico molecular em pacientes com suspeita de neoplasias mieloproliferativas.

Este caso reafirma o valor de uma implementação bem desenhada, alinhada com a realidade do laboratório, e reforça o nosso compromisso com uma medicina de precisão mais ágil, rastreável e eficaz.