As metodologias de purifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cidos nucleicos constituem a base fundamental das t\u00e9cnicas de an\u00e1lise molecular em biomedicina. As amostras de partida s\u00e3o muito variadas, desde isolados celulares at\u00e9 amostras fixadas em formalina ou inclu\u00eddas em parafina, e abrangem t\u00e9cnicas desde PCR de ponto final at\u00e9 sequencia\u00e7\u00e3o de alto rendimento. Assim, o impacto das diferentes t\u00e9cnicas de fragmenta\u00e7\u00e3o do material gen\u00e9tico pode aumentar a precis\u00e3o, permitir o desenvolvimento de algoritmos de corre\u00e7\u00e3o de erros, otimizar os produtos de PCR para sequencia\u00e7\u00e3o de amplic\u00f5es, aumentar a especificidade nas sequ\u00eancias a fragmentar e melhorar o rendimento e a integridade na fragmenta\u00e7\u00e3o. Em geral, procura-se melhorar a qualidade dos dados obtidos, tanto em t\u00e9cnicas de rotina como em metodologias avan\u00e7adas, como por exemplo a dete\u00e7\u00e3o de genes de fus\u00e3o, SNVs e SNPs.<\/p>\n\n\n\n
Neste caso, vamos centrar-nos no impacto dos m\u00e9todos de fragmenta\u00e7\u00e3o do ADN em NGS, onde a constru\u00e7\u00e3o das bibliotecas constitui um passo-chave para a an\u00e1lise e interpreta\u00e7\u00e3o dos resultados.<\/p>\n\n\n\n
Ent\u00e3o, como afetam os m\u00e9todos de fragmenta\u00e7\u00e3o do ADN a identifica\u00e7\u00e3o de variantes?<\/strong><\/p>\n\n\n\n As diferentes t\u00e9cnicas de fragmenta\u00e7\u00e3o do ADN podem introduzir erros de sequencia\u00e7\u00e3o \u00fanicos, o que pode comprometer a precis\u00e3o na identifica\u00e7\u00e3o de variantes.<\/p>\n\n\n\n A fragmenta\u00e7\u00e3o por sonica\u00e7\u00e3o<\/strong>, que utiliza ondas ultrass\u00f3nicas para cortar o ADN, \u00e9 uma t\u00e9cnica amplamente utilizada devido \u00e0 sua capacidade de produzir fragmentos com tamanhos uniformes. No entanto, a sonica\u00e7\u00e3o pode induzir danos oxidativos no ADN, sobretudo les\u00f5es que causam artefactos sob a forma de substitui\u00e7\u00f5es. Um exemplo \u00e9 a les\u00e3o oxidativa 8-oxo-G, que pode originar substitui\u00e7\u00f5es como C:G>A:T e C:G>G:C, erros comuns em bibliotecas geradas por sonica\u00e7\u00e3o.<\/p>\n\n\n\n Al\u00e9m dos danos oxidativos, a sonica\u00e7\u00e3o tamb\u00e9m pode criar leituras quim\u00e9ricas com sequ\u00eancias invertidas repetidas (IVS)<\/strong>. Estas surgem quando fragmentos de ADN de cadeia simples com IVS da mesma mol\u00e9cula se emparelham durante a repara\u00e7\u00e3o dos extremos, levando \u00e0 inclus\u00e3o de sequ\u00eancias da cadeia oposta.<\/p>\n\n\n\n Por outro lado, a fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica<\/strong> utiliza endonucleases para digerir o ADN. \u00c9 uma alternativa popular pela sua facilidade de uso, escalabilidade e pela perda m\u00ednima de ADN. Contudo, a fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica tende a introduzir mais SNVs e dele\u00e7\u00f5es do que a sonica\u00e7\u00e3o, associadas especialmente a sequ\u00eancias palindr\u00f3micas.<\/p>\n\n\n\n Importa referir que os tipos de artefactos variam consoante o protocolo espec\u00edfico de sonica\u00e7\u00e3o ou fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica utilizado.<\/p>\n\n\n\n Esses artefactos podem gerar chamadas de variantes que dificultam a an\u00e1lise subsequente e conduzem a interpreta\u00e7\u00f5es erradas.<\/p>\n\n\n\n E que estrat\u00e9gias ajudam a mitigar esses erros?<\/strong><\/p>\n\n\n\n O modelo PDSM<\/strong> (partial single strands derived from a similar molecule<\/em>) sugere que o ADN bicaten\u00e1rio \u00e9 fragmentado aleatoriamente por sonica\u00e7\u00e3o, criando mol\u00e9culas parcialmente de cadeia simples que se podem emparelhar com sequ\u00eancias complementares noutros fragmentos da mesma mol\u00e9cula. Este emparelhamento d\u00e1 origem a leituras quim\u00e9ricas e \u00e0 introdu\u00e7\u00e3o de muta\u00e7\u00f5es durante a repara\u00e7\u00e3o dos extremos e a amplifica\u00e7\u00e3o por PCR.<\/p>\n\n\n\n Este modelo tamb\u00e9m explicaria os erros na fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica. As endonucleases criam quebras no ADN, originando regi\u00f5es de cadeia simples. Se estas contiverem sequ\u00eancias palindr\u00f3micas, podem emparelhar-se com sequ\u00eancias complementares da mesma mol\u00e9cula. A repara\u00e7\u00e3o dos extremos e a forma\u00e7\u00e3o do chamado A-tailing<\/strong> podem introduzir muta\u00e7\u00f5es e leituras quim\u00e9ricas. Ao contr\u00e1rio da sonica\u00e7\u00e3o, na fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica estas muta\u00e7\u00f5es ocorrem sobretudo antes da PCR.<\/p>\n\n\n\n Como se comparam os m\u00e9todos de fragmenta\u00e7\u00e3o do ADN?<\/strong><\/p>\n\n\n\n Focamo-nos aqui na fragmenta\u00e7\u00e3o para prepara\u00e7\u00e3o de bibliotecas em Hybrid-capture Sequencing<\/strong>, uma t\u00e9cnica amplamente usada na sequencia\u00e7\u00e3o de exomas, genotipagem, descoberta de novos genes, dete\u00e7\u00e3o de InDels e SNPs raros.<\/p>\n\n\n\n V\u00e1rios estudos comparativos observaram uma quantidade significativamente maior de artefactos como SNVs, inser\u00e7\u00f5es e dele\u00e7\u00f5es em bibliotecas preparadas com fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica. Isto sugere que, embora esta t\u00e9cnica seja pr\u00e1tica e escal\u00e1vel, introduz mais erros de sequencia\u00e7\u00e3o, afetando diretamente a precis\u00e3o na identifica\u00e7\u00e3o de variantes.<\/p>\n\n\n\n Como j\u00e1 referimos, os principais artefactos s\u00e3o as leituras quim\u00e9ricas com IVS (cis e trans) no caso da sonica\u00e7\u00e3o, e as leituras com sequ\u00eancias palindr\u00f3micas com bases n\u00e3o coincidentes no caso da fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica.<\/p>\n\n\n\n Outro fator importante \u00e9 o momento<\/strong> em que ocorrem as muta\u00e7\u00f5es. Observou-se que na sonica\u00e7\u00e3o surgem sobretudo durante a PCR, enquanto na enzim\u00e1tica aparecem antes, durante a repara\u00e7\u00e3o final e a forma\u00e7\u00e3o do A-tailing, o que indica que cada m\u00e9todo influencia a etapa em que os erros s\u00e3o introduzidos.<\/p>\n\n\n\n Concluindo: o que devo ter em conta ao escolher um m\u00e9todo?<\/strong><\/p>\n\n\n\n As ferramentas bioinform\u00e1ticas ajudam a mitigar estes erros atrav\u00e9s de algoritmos que identificam e filtram variantes de artefactos com base na presen\u00e7a de IVS e PS no genoma de refer\u00eancia. Estes algoritmos reduzem significativamente os falsos positivos tanto em bibliotecas por sonica\u00e7\u00e3o como enzim\u00e1ticas, garantindo assim a precis\u00e3o na identifica\u00e7\u00e3o de variantes nos fluxos de trabalho em NGS.<\/p>\n\n\n\n Al\u00e9m disso, a otimiza\u00e7\u00e3o dos par\u00e2metros de fragmenta\u00e7\u00e3o pode ajudar a reduzir erros. Por exemplo, escolher cuidadosamente os par\u00e2metros de sonica\u00e7\u00e3o pode minimizar os danos oxidativos no ADN. De igual forma, o uso de enzimas com baixo vi\u00e9s de sequ\u00eancia pode reduzir a taxa de erro na fragmenta\u00e7\u00e3o enzim\u00e1tica.<\/p>\n\n\n\n Assim, a escolha do m\u00e9todo de fragmenta\u00e7\u00e3o adequado requer uma an\u00e1lise cuidadosa da aplica\u00e7\u00e3o espec\u00edfica e da taxa de erro potencial. Compreender os mecanismos e caracter\u00edsticas destes erros \u00e9 fundamental para interpretar corretamente os dados e tomar decis\u00f5es informadas a partir dos resultados da an\u00e1lise.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" As metodologias de purifica\u00e7\u00e3o de \u00e1cidos nucleicos constituem a base fundamental das t\u00e9cnicas de an\u00e1lise molecular em biomedicina. 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